LC液相色譜儀是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上,于20世紀(jì)60年代后期引入了LC液相色譜儀理論而迅速發(fā)展起來的。與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻。因?yàn)檩^小的填充顆粒具有高柱效,但會(huì)引起高阻力,需用高壓輸送流動(dòng)相,故又稱高壓液相色譜。
使用LC液相色譜儀時(shí),液體待檢測(cè)物被注入色譜柱,通過壓力在固定相中移動(dòng),由于被測(cè)物種不同物質(zhì)與固定相的相互作用不同,不同的物質(zhì)順序離開色譜柱,通過檢測(cè)器得到不同的峰信號(hào),zui后通過分析比對(duì)這些信號(hào)來判斷待測(cè)物所含有的物質(zhì)。LC液相色譜儀作為一種重要的分析方法,廣泛地應(yīng)用于化學(xué)和生化分析中。液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒有本質(zhì)的差別,它的特點(diǎn)是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測(cè)器和微粒固定相,適于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機(jī)化合物。
LC液相色譜儀的構(gòu)造
液相色譜系統(tǒng)主要由流動(dòng)相儲(chǔ)液瓶、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和記錄儀組成,其整體組成類似于氣相色譜,但是針對(duì)其流動(dòng)相為液體的特點(diǎn)作出很多調(diào)整。液相色譜的輸液泵要求輸液量恒定平穩(wěn),進(jìn)樣系統(tǒng)要求進(jìn)樣便利、切換嚴(yán)密。同時(shí),由于液體流動(dòng)相黏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氣體,為了減低柱壓,液相色譜的色譜柱一般比較粗,長(zhǎng)度也遠(yuǎn)小于氣相色譜柱。
LC液相色譜儀它包括空柱和填料??罩莾?nèi)壁拋光的不銹鋼管,內(nèi)徑為4~5mm,長(zhǎng)100~250mm。按氣相色譜法中洗滌空柱的方法洗凈,用勻漿法填充固定相。將此柱裝入儀器的管路中,用柱式機(jī)械往復(fù)泵輸入新鮮脫氣的流動(dòng)相。
等基線平直后可用苯、萘、菲的混合試液,用正己烷(含 0.05%甲醇)或甲醇:水(83:17)為流動(dòng)相測(cè)定柱效及分離度塔板數(shù)在2~3萬/ml以上及分離度在1.5以上者,柱效好。為防止柱污染,常用1個(gè) 50mm長(zhǎng),4~5mm內(nèi)徑,裝有硅膠(40-50mm)或立柱相同填料的保護(hù)柱(預(yù)柱)接在主柱之前,以延長(zhǎng)色譜柱的壽命。反相鍵合相柱用畢。必須用水充分流經(jīng),以洗去鹽類、酸堿等雜質(zhì)防止柱生銹及填料中雜質(zhì)的積聚,再用甲醇流經(jīng)洗滌使色譜柱獲得再生。
流動(dòng)相的洗脫方式配好經(jīng)脫氣的流動(dòng)相放于貯液瓶中,經(jīng)過有濾過頭、內(nèi)徑2mm的聚四氟乙烯管流入高壓泵進(jìn)入色譜柱,zui后自檢測(cè)器流出或收集或作廢液回收。用流動(dòng)相洗脫的方式有恒溶劑脫洗法,即自洗脫開始到結(jié)束,溶劑的配比恒定。
另一類為梯度洗脫法,即使溶劑的極性強(qiáng)度在色譜過程中逐漸增加。須按一定程序不斷改變流動(dòng)相的濃度配比,從而使同一個(gè)試樣中組分性質(zhì)相差較小的及較大的都能在一次色譜過程中很好分離,而整個(gè)色譜過程縮短。必須注意,梯度洗脫法不能用于分子排阻色譜及用電化學(xué)檢測(cè)的反相液相色譜法中。
LC液相色譜儀是一類分離與分析技術(shù),其特點(diǎn)是以液體作為流動(dòng)相,固定相可以有多種形式,如紙、薄板和填充床等。在色譜技術(shù)發(fā)展的過程中。為了區(qū)分各種方法,根據(jù)固定相的形式產(chǎn)生了各自的命名,如,紙色譜、薄層色譜和柱液相色譜。
LC液相色譜儀的使用和維護(hù)注意事項(xiàng):
?、俦苊鈮毫蜏囟鹊募眲∽兓叭魏螜C(jī)械震動(dòng)。柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料,因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行,在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩。
?、趹?yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成,特別是反相色譜中,不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?,反之亦然?/div>
?、垡话阏f來色譜柱不能反沖,只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí),才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。
?、苓x擇使用適宜的流動(dòng)相(尤其是pH),以避免固定相被破壞。
?、荼苊鈱?fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi),需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。
?、藿?jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱,清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。
?、弑4嫔V柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇,柱接頭要擰緊,防止溶劑揮發(fā)干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置至次日或更長(zhǎng)時(shí)間。
⑧色譜柱使用過程中,如果壓力升高,一種可能是濾片被堵塞,這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗;另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi),使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形,則可能柱頭出現(xiàn)塌陷,死體積增大。
?、嵋怨枘z為基質(zhì)的填料,只能在pH2~9范圍內(nèi)使用。每次分析檢測(cè)完成后,用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗,例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。
對(duì)LC液相色譜儀的要求
1、流動(dòng)相必須用HPLC級(jí)的試劑,使用前過濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45μm或更細(xì)的膜過濾)。
2、流動(dòng)相過濾后要用超聲波脫氣,脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。
3、不能用純乙腈作為流動(dòng)相,這樣會(huì)使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進(jìn)液。
4、使用緩沖溶液時(shí),做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí),然后用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗40分鐘以上,以充分洗去離子。對(duì)于柱塞桿外部,做完樣品后也必須用去離子水沖洗20mL以上。
5、長(zhǎng)時(shí)間不用儀器,應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存,注意不能用純水保存柱子,而應(yīng)該用有機(jī)相(如,甲醇等),因?yàn)?,純水易長(zhǎng)霉。
6、每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑清洗進(jìn)樣器。
7、C18柱不能進(jìn)蛋白樣品,血樣、生物樣品。
8、堵塞導(dǎo)致壓力太大,按預(yù)柱→混合器中的過濾器→管路過濾器→單向閥檢查并清洗,清洗方法:
?、僖援惐甲魅軇_洗;
?、诜旁诋惐贾虚g用超聲波清洗;
③用10%稀硝酸清洗;
9、氣泡會(huì)致使壓力不穩(wěn),重現(xiàn)性差,所以在使用過程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。
10、如果進(jìn)液管內(nèi)不進(jìn)液體時(shí),要使用注射器吸液:通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相的清洗。
11、要注意柱子的pH值范圍,不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品,特別是堿性樣品。
12、LC液相色譜儀更換流動(dòng)相時(shí)應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動(dòng)邊靖洗,然后插入新的流動(dòng)相中。更換無互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過渡一下。